• Edição 229
  • 19 de agosto de 2010

Teses

Estudo avalia efeitos inflamatórios associados a formação de edema ao recrutamento de leucócitos

Geralda Alves

 “Ativação de Eosinófilos pela Bradicinina” é o titulo da tese de doutorado de Ilka Maria Bakker Coelho de Abreu, aluna do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF/UFRJ). O estudo avalia a bradicinina (BK), um peptídeo inflamatório envolvido em diversos processos, sendo associada à nocicepção e inflamação neurogênica, à formação de edema e ao recrutamento de leucócitos.  

No presente trabalho foram estudados os efeitos que a BK exerce sobre eosinófilos humanos diretamente, em um modelo in vitro, bem como sobre eosinófilos murinos em modelos in vivo de inflamação pelural. Foi mostrado em um ensaio que evidencia mudanças morfológicas que a BK não tem efeitos sobre a locomoção eosinofílica. 

 “Diferentemente, pôde ser constatado um efeito ativador da BK sobre eosinófilos, uma vez que a interação com seu receptor B2R levou à biogênese de corpúsculos lipídicos (lipid bodies; LBs) citoplasmáticos, acompanhado pela síntese e secreção de prostaglandina (PG) E2, mas não de tromboxano B2 ou PGD2”, explica a doutoranda.  

Segundo Ilka, a síntese de PGE2 induzida pela BK em eosinófilos humanos apresentou ser aguda, uma vez que foi evidenciada por EicosaCell após apenas 15 min de incubação. “Foi reconhecida a dependência da ação endógena de metabólitos das ciclooxigenases 1 e 2, potencialmente uma alça de retroalimentação de PGE2 e PGD2, para a biogênese de LBs induzida pela BK. Ao estudar as vias de sinalização envolvidas neste processo pôde ser observado que a BK exerce seus efeitos via efetores down-stream da adenosina de monofosfato cíclico (cyclic adenosine monophosphate; cAMP), isto é proteína cinase (PK) A e fator de troca ativado por cAMP (Epac), mas não via alterações detectáveis nos níveis intracelulares de cálcio ou via ativação de PKC”, analisa a estudante.  

“Curiosamente, apesar da BK sinalizar via aumentos de cAMP, também pôde ser constatada a síntese e secreção de leucotrieno cisteinado (cysteinyl-leukotriene; cys-LT) por estas células quando estimuladas com BK. Em um modelo murino de pleurisia alérgica foi mostrada a relevância da ação da BK in vivo, uma vez que levou ao recrutamento e à ativação de eosinófilos ao local inflamado. A administração exógena no espaço pleural de BK foi suficiente para mimetizar estes efeitos, acompanhado também por aumentos nos níveis de cys-LT na cavidade pleural sendo potencialmente provinientes da atividade sintética e secretória dos eosinófilos recrutados, como demonstrado por imunomarcação intracelular por EicosaCell”, relata Ilka 

Para concluir o elstudo aponta BK capaz de ativar eosinófilos diretamente in vitro, mas também de recrutar e ativar eosinófilos in vivo. “No modelo in vitro foi mostrada a iniciação de uma alça de retroalimentação de prostanóides dependente da ação de PKA e Epac, mas não de cálcio e PKC, ainda levando à síntese e secreção de cys-LT nos eosinófilos humanos estimulados com BK”, encerra a doutoranda.  

Defesa 

A dissertação “Ativação de Eosinófilos pela Bradicinina” teva a orientação dos professores Christianne Bandeira de Melo e Julio Scharfstein, ambos do IBCCF e a defesa acontece segunda-feira (23/08), às 14h, na sala G1-022, do IBCCF – Centro de Ciências da Saúde (CCS), Cidade Universitária.

Estudo desenvolve ferramenta de teste de diagnóstico alternativo do vírus da dengue 2

Geralda Alves

O vírus da dengue (Denv) infecta milhões de pessoas a cada ano, sendo um dos principais problemas de saúde pública mundial. As metodologias utilizadas atualmente não são adequadas para o diagnóstico precoce da doença ou são muito caras, dificultando sua utilização na maioria dos países, onde o Denv é endêmico.

Pensando nisso, o mestrando Diego Allonso Rodrigues dos Santos da Silva do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF/UFRJ) desenvolveu o estudo intitulado “Caracterização funcional da proteína NS1 do vírus da dengue 2: ferramenta para o desenvolvimento de teste de diagnóstico alternativo”.

Segundo Diego Allonso a proteína NS1 constitui alvo interessante para o diagnóstico da doença, pois é encontrada no soro de pacientes tanto na infecção primária, quanto na infecção secundária. “Ela é uma glicoproteína de aproximadamente 45 kDa e funcionalmente ativa como homodímero. A NS1 foi expressa em células de E. coli e quatro protocolos diferentes foram utilizados para sua recuperação, a fim de determinar qual deles é capaz de gerar maior rendimento e manter as propriedades bioquímicas e imunológicas da proteína”, explica o mestrando.

A análise da estrutura terciária revelou que os protocolos utilizados foram capazes reenovelar a proteína NS1 recombinante (rNS1b). “A análise da estrutura secundária mostrou que ela é composta por 27% de a-hélices, 43% de folhas-b e 30% de estrutura desordenada. Todos os protocolos utilizados produziram a proteína rNS1bac na forma dimérica, em uma conformação semelhante a da proteína expressa em células de mamíferos. Anticorpos anti-NS1 produzidos a partir desta proteína foram capazes de reconhecer a proteína NS1 presente no soro de pacientes através de western blot”, revela Diego.

Com isso, um painel de 43 soros foi analisado por ELISA de captura, que revelou que 100% das amostras positivas para Denv2 foram detectadas e 60% das amostras positivas para dengue, mas que não foram detectadas pelos kits de diagnóstico comerciais, foram detectadas pela metodologia proposta no trabalho. Os resultados confirmaram a utilidade dos anticorpos produzidos para o desenvolvimento de uma metodologia sensível e rápida para a detecção da dengue, ideal para o diagnóstico populacional.

De acordo com o estudo, a proteína NS1 foi expressa também em células de levedura Pichia pastoris, a fim de produzir a proteína na forma glicosilada. “Para isso, o gene ns1 de DENV2 foi clonado no plasmídio pPICZaB e expresso  em células GS115”.

O ensaio de otimização da expressão revelou que a proteína NS1 é super-expressa após 72 horas, com indução de 0,7% de metanol a cada 24 horas. A proteína foi cultivada em grande quantidade e purificada pelo método de imunocromatografia desenvolvido na dissertação.

“A proteína purificada estava basicamente na forma dimérica e glicosilada em, pelo menos, 2 sítios, corroborando com os dados da literatura. Os resultados mostram que a expressão em leveduras P. pastoris foi bem sucedida, produzindo a proteína NS1 semelhante à de células de mamífero”, conclui Diego.

Defesa

A tese, que será defendida às 13h, da próxima terça-feira (24/08), na sala G1-022, no bloco G do Centro de Ciências da Saúde (CCS), na Cidade Universitária, contou com a orientação do professor Ronaldo da Silva Mohana Borges (IBCCF/UFRJ).

 

Expressão de gene no fígado e no rim por hormônios tireoideanos em Camundongos

Geralda Alves

Larissa Costa Faustino, mestranda do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF/UFRJ), defende a tese “Regulação da Expressão da Glutationa S-Transferase por Hormônios Tireoideanos em Camundongos Normais e Transgênicos”, na próxima terça-feira (24/08), às 14, na sala G1-09, do Centro de Ciências da Saúde (CCS), Cidade Universitária.

A mestranda explica a tese, informando que o gene que codifica a isoforma GSTA1/2 pertencente à classe alpha da superfamília das enzimas glutationa S-transferase constitui um gene alvo negativo dos hormônios tireoideanos no fígado. No rim, essa enzima também é bastante expressa, porém pouco é conhecido a respeito de suas funções e regulação hormonal neste órgão.

No trabalho, orientado pela professora Tânia Maria Ortiga Carvalho, do IBCCF, foi avaliada a expressão desse gene, no fígado e rim, em camundongos normais e camundongos que exibem mutação delta 337T no receptor de hormônio tireoideanos tipo b, impedindo a ligação da triiodotironina. “Estudamos também a expressão da desiodase tipo 1, um gene regulado positivamente pelos hormônios tireoideanos, utilizado como controle positivo”, relata a mestranda.

Os camundongos normais, de ambos os sexos, foram induzidos ao hipotireoidismo e ao hipertireoidismo, enquanto os camundongos mutantes foram submetidos ao hipotireoidismo seguido da administração de doses crescentes de triiodotironina. No fígado, não foram encontradas diferenças significativas na expressão da GSTA1/2 entre os sexos.

No entanto, no rim, o estudo apontou acentuado dimorfismo sexual, em que as fêmeas expressam quantidades abundantes da enzima em relação aos machos. O hipotireoidismo induziu aumento na expressão do gene, tanto no fígado de camundongos de ambos os sexos como no rim de machos, em relação ao eutireoidismo. No rim de fêmeas, o hipotireodismo diminuiu os níveis de expressão em relação ao eutireodismo, ao contrário do comportamento observado nos machos.

“Acreditamos que uma possível interação entre as vias de sinalização do estradiol e dos hormônios tireoideanos possa explicar a regulação diferencial dessa enzima nos rins de fêmeas. A importância dos nossos dados ainda não é clara, mas sugere-se que eles estejam relacionados com uma maior capacidade de detoxificação renal das fêmeas. Nos animais mutantes, a expressão GSTA1/2 estava aumentada no fígado, indicando papel predominante da isoforma tipo b do receptor de hormônio tireoideano sobre a regulação desse gene”, afirma Larissa.

Segundo ela, após tratamento de indução ao hipotireoidismo seguido das doses crescentes de triiodotironina, a GSTA1/2 estava suprimida após a última dose, enquanto a isoforma tipo a1 do receptor de hormônio tireoideano estava aumentada. “É possível que tais achados possam ser explicados por um possível envolvimento da isoforma TRa1 na modulação da supressão desse gene por hormônios tireoideanos. Nossos resultados sugerem a presença de diferenças específicas ao tecido e ao sexo do animal na regulação gênica da GSTA1/2, no entanto, os mecanismos responsáveis por essa modulação diferencial ainda necessitam ser elucidados”, conclui a mestranda.

Parasitos do trato urogenital bovino e humano é estudo em tese de mestrado da UFRJ

Geralda Alves

Tritrichomonas foetus e Trichomonas vaginalis são parasitos do trato urogenital bovino e humano, respectivamente. T. vaginalis é o agente etiológico da tricomonose humana, enquanto T. foetus é o responsável pela tricomonose bovina. Apesar de vários estudos, pouco se conhece sobre os fatores que conduzem aos quadros graves de infecção da tricomonose, podendo levar ao aborto e esterilidade temporária ou permanente.  

No intuito de investigar os efeitos citotóxicos de T. foetus e T. vaginalis em regiões mais profundas do trato reprodutivo, o mestrando Ricardo Chaves Vilela, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF/UFRJ), realizou a interação desses parasitos com células que constituem os tecidos conjuntivo e muscular.  

Ricardo também verificou na tese, a capacidade de T. foetus e T. vaginalis em ativar a liberação de citocinas em uma cultura de células epiteliais de origem bovina. Os vários estudos publicados sobre a interação parasito-célula hospedeira apresentam controvérsias sobre a capacidade de T. vaginalis e T. foetus interagir e danificar células de diferentes origens e espécies.   

“Foi obtida uma cultura primária de fibroblastos humanos, a partir de biópsias de abdômen. As linhagens 3T3 de fibroblastos e L6 de mioblastos, ambas oriundas de camundongos, também foram cultivadas como modelos de células-alvo. Para verificar a resposta inflamatória induzida pelos parasitos, foi obtida cultura primária de células epiteliais de oviduto bovino e feita a interação por 12 horas”, explica Ricardo.  

Com o intuito de verificar se T. foetus era capaz de infectar células humanas, foi realizada a interação de T. foetus com células vaginais humanas coletadas com “swab”. De acordo com o mestrando, as interações foram processadas para MEV e MET. “Para verificar se os parasitos induziram morte celular por apoptose nas células-alvo, as interações foram processadas para microscopia de fluorescência, utilizando o marcador TUNEL, que detecta DNA fragmentado e JC-1, que mede a viabilidade mitocondrial”, analisa.

Ensaios colorimétricos como o cristal violeta foram realizados para a análise da citotoxicidade exercida pelos parasitos. A liberação de citocinas das células de oviduto em interação com T. vaginalis e T. foetus foi analisada.  

Segundo os estudos, os resultados obtidos mostraram que T. vaginalis e T. foetus aderem e são citotóxicas aos fibroblastos e às células musculares. Nas análises por JC-1 foi observado que os parasitos induziram morte celular por apoptose. A interação de células vaginais humanas com T. foetus mostrou-se positiva, com vários parasitos fortemente aderidos.  

Foi encontrado um grande aumento na concentração da citocina IL-10 nos sobrenadantes com a interação entre T. foetus e células epiteliais de oviduto bovino, diferentemente do resultado com T. vaginalis que induziu apenas um pequeno aumento na liberação de citocinas, após interação com as células bovinas. Ambos osparasitos foram capazes de interagir com fibroblastos e células musculares indicando que podem infectar os tecidos conjuntivos e musculares levando sérios riscos ao hospedeiro infectado. 

Além disso, a interação de T. foetus com células vaginais humanas desmistificaria a ideia de a interação tricomonas-célula hospedeira ser espécie-específica. “Apesar da adesão e citotoxicidade dos parasitos não serem espécie-específicas, parece que a resposta inflamatória da célula hospedeira depende de reconhecimento específico, como foi mostrado em nosso estudo onde apenas T. foetus e não T. vaginalis induziu a liberação da citocina IL-10 em células bovinas”, finaliza Ricardo. 

Defesa

O estudo intitulado “Interação de Trichomonas vaginalis e Tritrichomonas foetus com diferentes tipos celulares” será defendido na próxima quinta-feira (25/08), às 10h, na sala G1-022 , do Centro de Ciências da Saúde (CCS), na Cidade Universitária.